Cari Blog Ini

Memuat...

Jumat, 10 September 2010

PRAK.Kultur Jaringan


I.          JUDUL PRAKTIKUM        : Sterilisasi Alat

II.        TUJUAN PRAKTIKUM     :-. Membersihkan peralatan praktikum.
                                                             -. Mengetahui cara sterilisasi alat
                                                             -. Mengetahui cara mengoperasionalkan alat
                  
III.       TINJAUAN TEORITIS      :

STERILISASI ALAT

            Salah satu faktor pembatas dalam kebersihan kultur jaringan adalah kontaminasi yang dapat terjadi pada setiap saat dalam masa kultur. Sterilisasi dalam kultur jaringan ada 3 tahap yaitu :
1.      Sterilisasi lingkungan kerja
Lingkungan kerja untuk teknik kultur jaringan dapat dibagi atas lingkungan umum dan lingkungan spesifik. Lingkungan umum adalah ruangan transfer secara keseluruhan, sedangkan lingkungan spesifik adalah lingkungan didalam laminar air flow cabinet dimana proses penanaman eksplan dan prosedur lain seperti isolasi protoplasma dilakukan.
2.      Sterilisasi alat-alat dan media
Alat-alat yang perlu disterilkan sebelum penanaman adalah: pinset, gunting, gagang scalpel, petridisk, botol-botol kosong, jarum suntik untuk isolasi meristem dan pipet untuk memindahkan suspensi sel.
Media dan aquades juga disterilkan dalam autoclave. Untuk aquades sebaiknya dimasukkan dalam wadah kecil misalnya elemeyer 250 ml dengan isi maksimum 100 ml, agar sterilisasi lebih efektif. Untuk media kultur yang tidak mengandung bahan-bahan yang heat-labile, sterilisasi dilakukan dengan autoclave pada suhu 1210C. 
3.      Sterilisasi bahan tanaman
Pada setiap jenis tanaman, ditemukan juga kontaminan yang berasal dari dalam jaringan tanaman, terutama bakteri. Bakteri-bakteri ini sampai sekarang belum diidentifikasi. Kontaminan internal ini sangat sulit diatasi, karena sterilisasi permukaan tidak menyelesaikan masalah. Pada bahan tanaman yang mengandung kontaminan internal, harus diberi perlakuan antibiotik atau fungisida yang sistemik.
Setiap bahan tanaman mempunyai tingkat kontaminasi yang berbeda tergantung dari :
a.       Jenis tanaman
b.      Bagian tanaman yang diperlukan
c.          Morfologi permukaan
d.      Lingkungan tumbuhnya
e.          Umur tanaman
f.          Kondisi tanaman
g.      Musim waktu mengambil
Sumber kontaminasi dapat barasal dari :
1.      Eksplan, baik kontaminasi eksternal maupun internal
2.      Organisme kecil yang masuk ke dalam media. Dengan keadaan di Indonesia, yang pling sering menyebabkan kontaminasi adalah semut.
3.      Botol kultur atau alat-alat yang kurang steril.
4.      Lingkungan kerja dan ruang kultur yang kotor (spora di udara)
5.      Kecerobohan dalam pelaksanaan.
Seperti yang dijelaskan diatas, alat-alat yang perlu disterilkan sebelum penanaman adalah : pinset, gunting, gagang scalpel, kertas saring, petri dish, botol-botol kosong, jarum suntik untuk isolasi meristem dan pipet untuk memindahkan suspensi sel. Alat-alat dan kertas saring dibungkus rapi dengan kertas tebal atau ditaruh dalam baki stainless steel dan bakinya dibungkus dengan kain tebal sebelum dimasukkan ke dalam autoclave. Alumunium foil tidak direkomendasikan sebagai pembungkus, karena uap tidak dapat masuk ke dalam bungkusan. Suhu yang digunakan untuk sterilisasi adalah 1210 C pada tekanan 17,5 psi (pounds per squareinch) selama 1 jam. Perhitungan waktu sterilisasi dimulai setelah tekanan yang diinginkan tercapai.
Alat-alat yang dipakai ketika penanaman harus dalam keadaan steril. Alat-alat logam dan dapat disterilisasikan dalam autoclave. Alat tanam seperti : pinset dan gunting dapat juga disterilkan dengan pembakaran atau dengan pemanasan, namun pisaunya (blade) dapat menjadi tumpul bila dipanaskan dalam suhu tinggi, oleh karena itu untuk bladenya dianjurkan cara sterilisasi dengan pencelupan dalam alkohol atau larutan kaporit (Syahmi edi, 2007)






IV. ALAT & BAHAN          :

Alat dan bahan yang digukan adalah sebagai berikut :
No
Alat dan bahan  
Jumlah
1.
Botol kultur
100 buah
2.
Deterjen
1     buah
3.
Air
Secukupnya
4.
Pemutih/bayklin
secukupnya 
5.
Box
1     buah
6.
Autoklaf
1   buah
7.
kompor
1  buah
8.
Alat tanam : pinset, gunting, cawan petridish, spatula
Masing-masing 1 buah

V.        PROSEDUR KERJA           :
            Adapun tahap-tahap yang dilakukan dalam sterilisasi alat-alat praktikum dijelaskan sebagai berikut :
  1. Menyediakan alat-alat yang akan digunakan dalam praktikum.
  2. Mencuci botol kultur dengan deterjen dan membilasnya dengan air yang mengalir.
  3. Meletakkan botol kultur yang telah dicuci secara terbalik agar cepat kering.
  4. Meletakkan botol-botol tersebut pada keranjang untuk dikeringkan, setelah kering botol-botol kultur tersebut dimasukkan kedalam autoclave selama 1 jam.
  5. Kemudian disimpan di dalam box yang telah dicuci dan disemprotkan alkohol 70%. Disimpan selama 1 minggu untuk menunggu praktikum selanjutnya.

VI.       PEMBAHASAN       :
            Dalam sterilisasi alat, ada 2 macam Sterilisasi, yaitu :
  1. Sterilisasi luar :
o   Sterilisasi luar merupakan sterilisasi alat-alat dengan menggunakan deterjen/sabun dan air yang mengalir. Botol-botol kultur dicuci dengan cara menggosok seluruh bagian botol (dalam dan luar) dengan menggunakan deterjen/sabun.
o   Kemudian membilas botol-botol kultur tersebut dengan air yang mengalir sampai air mengenai seluruh bagian botol dan membersihkan bekas-bekas deterjen/sabun.
o   Setelah dibilas dengan air mengalir, botol diletakkan ditempat yang sudah disemprot dengan  alkohol
2.   Sterilisasi dalam :
o   Sterilisasi dalam dilakukan dengan cara memasukkan botol-botol kultur ke dalam autoclave. Alat-alat yang disterilisasi dengan autoclave adalah alat yang berupa logam dan gelas.
o   Botol-botol kultur dan alat-alat tanam yang dibungkus dengan kertas dimasukkan kedalam autoclave selama 1 jam. Suhu yang digunakan untuk sterilisasi adalah 1210C karena pada suhu tinggi tersebut mikroba akan mati pada tekanan 17,5 psi (pounds per squareinch).
o   Perhitungan waktu sterilisasi dimulai setelah tekanan yang diinginkan tercapai.
Pada prinsipnya, peralatan yang digunakan dalam praktikum ini haruslah steril. Karena peralatan yang tidak steril akan dapat menjadi sumber kontaminan sehingga menggagalkan percobaan kultur jaringan yang dilakukan.
Selain peralatan seperti : pinset, gunting, gagang scalpel, petridisk, botol-botol kosong, jarum suntik untuk isolasi meristem dan pipet untuk memindahkan suspensi sel, media dan aquades yang digunakan juga harus disterilisasi. Namun terkadang hal itu saja tidaklah cukup karena sterilisitas dari praktikan juga sangat mempengaruhi. Jadi apabila praktikan akan melakukan percobaan, maka praktikan harus membersihkan dirinya terlebih dahulu. Diantaranya praktikan dapat melakukan hal-hal sebagai berikut : mandi, mencuci tangan dan kaki dengan sabun, mengganti pakaian yang bersih atau pakaian khusus praktik, dan usaha-usaha lain yang dapat menghindarkan kontaminasi.



VII.     KESIMPULAN         :
            Dari praktikum yang dilakukan dapat dibuat kesimpulan sebagai berikut :
  1. Sterilisasi dilakukan dengan 3 tahap, yaitu :
| Sterilisasi lingkungan kerja
| Sterilisasi alat-alat dan medium
| Sterilisasi bahan tanaman
  1. Sumber kontaminasi dapat berasal dari :
­ Eksplan, baik kontaminasi eksternal yang disebabkan oleh kelalaian praktikan                   dan kontaminasi internal yang disebabkan oleh mikroorganisme yang menyusup masuk kedalam jaringan eksplan.
­ Organisme kecil yang masuk kedalam media.
­ Botol kultur atau alat-alat yang kurang steril
­ Linkungan kerja dan ruang kultur yang kotor (karena spora di udara)
­ Kecerobohan dalam pelaksanaan.
  1. Selain sterilisasi alat yang digunakan juga harus diperhatikan sterilisasi dari praktikan itu sendiri yang senantiasa harus selalu dijaga.

VIII.    DAFTAR PUSTAKA          :          

Edi, syahmi., 2007, Penuntun Praktikum Kultur Jaringan Tanaman, Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Negeri Medan, Medan.

Harahap, F., 2007, Kultur Jaringan Suatu Pengantar, Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Negeri Medan, Medan.
Yusnita, 2003, Kultur Jaringan Cara Memperbanyak Tanaman Secara Efisien, AgroMedia Pustaka, Jakarta.


I.          JUDUL PRAKTIKUM        : Pembuatan Media
II.        TUJUAN PRAKTIKUM     :-. Melatih praktikan agar mengetahui cara      
                                                                pembuatan media dalam Keadaan aseptik.
                                                             -. Melatih praktikan membedakan jenis media.
                                                             -. Melatih praktikan memanfaatkan media
                                                             -. Mengetahui komposisi media kultur
III.       TINJAUAN TEORITIS      :

PEMBUATAN MEDIA TANAM
            Pembuatan media pada prinsipnya dilakukan dengan melarutkan semua komponen media dalam air, sesuai dengan konsentrasinya pada formulasi yang diinginkan. Namun, penimbangan satu persatu komponen media untuk setiap pembuatan media kultur adalah tidak praktis,  memakan banyak waktu/tidak efisien, mengurangi ketepatan dan hanya dapat dilakukan jika jumlah zatnya cukup besar untuk ditimbang. Selain itu timbangan yang digunakan untuk menimbang sejumlah kecil bahan kimia kadang-kadang tidak tersedia. Masalah tersebut dapat diatasi dengan pembuatan larutan stok. Setiap larutan stok dapat dipergunakan untuk 40-50 bahkan 100 liter medium. Jadi dalam pelaksanaanya kita melakukan pemekatan larutan. Larutan stok dalam bentuk cairan disimpan di dalam lemari es.
Larutan stok dibuat dengan mengelompokkannya dalam bentuk : stok besi (iron), stok mikro nutrien, stok vitamin dan stok hormon. Untuk stok makro nutrien, umumnya tidak dikelompokkan dalam satu stok, kadang-kadang dibuat dalam larutan stok tunggal.  Hal yang perlu diperhatikan dalam pembuatan larutan stok adalah mengenai penyimpanan (daya simpan) larutan. Larutan yang sudah mengalami pengendapan tidak dapat digunakan lagi. Pengendapan larutan stok umumnya terjadi bila kepekatan larutan terlalu tinggi. Oleh karena itu pengendapan larutan dapat dihindari dengan membuat larutan tidak terlalu pekat atau tidak menggunakan larutan campuran, yaitu dengan membuat satu larutan stok hanya untuk satu jenis bahan (terutama untuk unsur hara makro). Kondisi penyimpanan juga perlu diperhatikan, karena ada beberapa bahan yang tidak tahan dalam suhu tinggi atau cahaya.            
            Larutan stok kadang-kadang ditumbuh mikroorganisme. Larutan yang terkontaminasi mikroorganisme ini, juga tidak dapat dipergunakan lagi. Oleh karena itu, kebersihan kondisi simpan harus dijaga dan tempat (wadah) larutan harus diusahakan serapat mungkin. Sebelum membuat medium , maka terlebih dahulu kita harus menentukan medium apa yang akan kita buat. Jenis medium dengan komposisi unsur kimia yang berbeda dapat digunakan untuk media tumbuh dari jaringan tanaman yang berbeda pula. Misalkan, medium vacin went sangat baik untuk media tumbuh anggrek, tatapi tidak cocok untuk media tumbuh tanaman yang lain. Untuk menanam eksplan dari tanaman keras sering menggunakanmedium WPM, sedangkan untuk tanaman semusim (sayuran dan tanaman hias) sering menggunakan medium MS. Media Knudson C hanya cocok untuk menanam eksplan kelapa kopyor dan anggrek.
Kita mengenal beberapa macam media dasar yang pada umumnya diberi nama sesuai dengan nema penemunya, yaitu :
  1. Medium Dasar Murashige dan Skoog  (MS) : digunakan untuk hampir semua macam tanaman. Medium ini mempunyai konsentrasi garam-garam mineral yang tinggi dan senyawa N dalam bentuk NO3-dan NH4+.
  2. Medium dasar B5 atau Gamborg : digunakan untuk kultur suspensi sel kedele, alfalfa, legume lainnya.
  3. Medium dasar White : digunakan untuk kultur akar. Medium ini merupakan medium dasar dengan konsentrasi garam-garam mineral yang rendah.
  4. Medium Vacin end Went (VW) : digunakan khusus untuk medium anggrek.
  5. Medium dasar Nitsch dan Nitsch : digunakan untuk kultur tepung sari (pollen) dan kultur sel.
  6. Medium dasar Schenk dan Hildebrandt : digunakan untuk tanaman monokotil.
  7. Medium dasar Woody Plant Medium : digunakan untuk tanaman yang berkayu.
  8. Medium dasar N6 : digunakan untuk tanaman serealia terutama padi.   
Faktor penentu di dalam media tumbuh adalah komposisi garam anorganik, zat pengatur tumbuh, dan bentuk fisik media. Komposisi garam anorganik telah dikembangkan berbagai ahli. Ada yang tinggi konsentrasi garamnya, ada yang sedang, dan ada yang rendah. Zat pengatur tumbuh memegang peranan penting dalam pertumbuhan dan perkembangan kultur. Faktor yang perlu mendapat perhatian dalam penggunaan zat pengatur tumbuh yang akan digunakan , konsentrasi, urutan pengguanaan dan periode masa induksi dalam kultur tertentu.


Jenis zat pengatur tumbuh yang digunakan :


    1. Giberelin
    -           GA3
    -           GA4 + GA7

    1. Zat penghambat tumbuh
    -          Ancymidol
    -     Paclobutrazol
    -     TIBA
    -     CCC


    Auksin                                    
-          IAA
-          NAA
-          2,4 D
-          CPA
-          IBA
  1. Sitokinin
-          kinetin
-          BAP/BA
-          2i-P
-          Zeatin
-          Thidiazuron
-          PBA

IV.      ALAT DAN BAHAN                       :
Adapun alat yang digunakan dalam praktikum adalah

No
Alat
Jumlah
1.
Timbangan digital
1 buah
2.
Beaker glass
2 buah
3.
Spatula
2 buah
4.
Pipet tetes
2 buah
5.
Pipet volum
3 buah
6.
Botol kultur
100 buah
7.
Plastik kaca
Secukupnya
8.
Karet & Plastik
Secukupnya
9.
Kertas pH
Secukupnya
10.
Autoklaf
1 buah
11.
Kompor
1 buah
12
Meja
1 buah


Adapun bahan yang digunakan dalam praktikum adalah

No
Bahan
Jumlah
1.
Larutan stok A 
1,65 gr
2.
Larutan stok B
1,9 gr
3.
Larutan Stok C
5 ml
4.
Larutan Stok D
5 ml
5.
Larutan Stok E
5 ml
6.
Larutan Stok F
5 ml
7.
Agar-agar
secukupnya
8.
2,4-Dikhloro fenoksiasetat
0,25 dan 0,125 ppm
9.
Kinetin
0,5 ppm
10.
HCl
Secukupnya
11.
KOH
Secukupnya
12.
Gula
15 gr
13.
IAA
0,1 ppm
14.
BAP
0,5 ppm
15.
Myo-inositol
Secukupnya
16.
vitamin
Secukupnya

V.        PROSEDUR KERJA                       :          
Media yang digunakan ada 4 jenis yaitu :
-          Media MS
-          Media MS 11 (BAP 0,5 ppm + IAA 0,1 ppm)
-          MS + kinetin 0,5 ppm + IAA 0,1 ppm
-          Media MS + :
A.    0,5 ppm kinetin + 0,25 ppm 2,4-D
B.     0,5 ppm kinetin + 0,125 ppm 2,4-D


Adapun prosedur kerja dalam pembuatan media adalah :
A. Media MS
  1. Menyiapkan alat-alat yang akan digunakan, yaitu : timbangan analitik, Erlenmeyer, gelas ukur, pipet volum, kompor gas, kertas pH, botol kultur, plastik kaca dan karet dan batang pengaduk.
  2. Menimbang Amonium Nitrat, Kalium Nitrat, Stok C sampai F, vitamin, gula dan mio-inositol.
  3. Membuat media dengan penambahan ZPT sesuai dengan kebutuhan praktikum, yaitu :
B. Untuk pembuatan media MS 11 (BAP 0,5 ppm + IAA 0,1 ppm)
  1. Memasukkan satu-persatu unsur-unsur hara makro dan mikro, vitamin, gula dan mio-inositol ke dalam gelas beker kemudian ditambah aquades sampai volum mendekati 500 ml.
  2. Kemudian dimasukkan 0,5 ppm BAP ditambah 0,1 ppm IAA. Ditambah aquades sampai mendekati 1000 ml. kemudian diaduk hingga rata.
  3. Mengukur pH-nya  dari 5,8 sampai 6 dengan menggunakan kertas lakmus, jika pH dibawah 5,8 larutan ditambah KOH dan jika pH diatas 6 maka larutan ditambah HCl.
  4. Kemudian ditambahkan aquades sampai volume 1000 ml.
  5. Menambahkan agar-agar, diaduk, kemudian dipanaskan diatas kompor sampai larut sambil diaduk dengan batang pengaduk.
  6. Kemudian larutan tersebut dimasukkan kedalam wadah yang mempunyai ukuran, untuk selanjutnya mengisi botol-botol kultur yang telah disterilisasi.
  7. Botol-botol kultur yang telah berisi media tersebut kemudian ditutup dengan plastik transparan dan diikat dengan karet gelang.
  8. Kemudian botol-botol kultur tersebut dimasukkan ke dalam autoclave selama 20 menit.
  9. Setelah selesai disterilisasi di autoclave, botol-botol kultur tersebut disusun rak kultur.  



C.  Untuk pembuatan Media MS + kinetin 0,5 ppm + IAA 0,1 ppm
  1. Memasukkan satu-persatu unsur-unsur hara makro dan mikro, vitamin, gula dan mio-inositol ke dalam gelas beker kemudian ditambah aquades sampai volum mendekati 500 ml.
  2. Menambahkan 0,5 ppm kinetin dan 0,1 ppm IAA. Ditambah aquades sampai mendekati 1000 ml. kemudian diaduk hingga rata.
  3. Mengukur pH-nya  dari 5,8 sampai 6 dengan menggunakan kertas lakmus, jika pH dibawah 5,8 larutan ditambah KOH dan jika pH diatas 6 maka larutan ditambah HCl.
  4. Kemudian ditambahkan aquades sampai volume 1000 ml.
  5. Menambahkan agar-agar, diaduk, kemudian dipanaskan diatas kompor sampai larut sambil diaduk dengan batang pengaduk.
  6. Kemudian larutan tersebut dimasukkan kedalam wadah yang mempunyai ukuran, untuk selanjutnya mengisi botol-botol kultur yang telah disterilisasi.
  7. Botol-botol kultur yang telah berisi media tersebut kemudian ditutup dengan plastik transparan dan diikat dengan karet gelang.
  8. Kemudian botol-botol kultur tersebut dimasukkan ke dalam autoclave selama 20 menit.
  9. Setelah selesai disterilisasi di autoclave, botol-botol kultur tersebut disusun rak kultur.  
D. Untuk pembuatan media MS + 1 ppm kinetin + 2,4-D….
  1. Memasukkan satu-persatu unsur-unsur hara makro dan mikro, vitamin, gula dan mio-inositol ke dalam gelas beker kemudian ditambah aquades sampai volum mendekati 500 ml.
  2. Kemudian dimasukkan 1 ppm kinetin, setelah itu larutan tersebut diaduk hingga rata dan ditambahkan akuades sampai volum 500 ml dan dibagi menjadi 2 bagian.
  3. Masing-masing bagian diberi nama A dan B. Larutan A ditambah 0,25 ppm 2,4-D dan larutan B ditambah 0,125 ppm 2,4-D.dan masing-masimg larutan diaduk hingga merata.
  4. Kemudian masing-masing larutan diukur PH-nya  dari 5,8 sampai 6 dengan menggunakan kertas pH, jika pH dibawah 5,8 larutan ditambah KOH dan jika pH diatas 6 maka larutan ditambah HC
  5. Larutan A dan B ditambah agar, kemudian dipanaskan diatas kompor sampai mendidih sambil diaduk dengan batang pengaduk.
  6. Setelah mendidih, media dituangkan ke botol kultur dan botol kultur ditutup dengan plastik dan diikat dengan karet.
  7. Kemudian botol-botol kultur tersebut dimasukkan ke dalam autoclave selama 20 menit.Setelah selesai disterilisasi di autoclave, botol-botol kultur tersebut disusun rak kultur. 
VI.       PEMBAHASAN                   :
            Dalam pembuatan media tanam, dilakukan pembuatan media yang terdiri dari beberapa jenis media, hal ini dilakukan untuk mengetahui cara pembuatan media dan untuk mengetahui media mana yang lebih sesuai sebagai media tanam terhadap eksplan ang sudah disediakan, dan dalam praktikum ini eksplan yang digunakan adalah tanaman kentang dan anggrek.
            Untuk keberhasilan dari pembuatan media tanam kondisi dari segala sesuatu yang berhubungan dengan pembuatan media seharusnya dalam keadaan yang aseptik, agar tidak terjadi kontaminasi terhadap media yang dibuat. Pembuatan media juga dapat tidak berhasil dikarenakan adanya kesalahan dalam pembuatan diantaranya kesalahan pemasukan stok-stok yang telah dibuat atau bahan lain yang telah tersedia.
            Pemasakan agar-agar yang terlalu lama dapat juga menyebabakan terjadinya karamelisasi. Hal itu juga dapat menyebabkan kegagalan pada pembuatan media tanam.
            Media tanam dapat mengalami kontaminasi, ketika media tanam telah mengalami kontam, media tersebut tidak dapat digunakan lagi.
            Dengan kata lain kegagalan dalam pembuatan media kultur dapat disebabkan oleh beberapa alasan, antara lain :
  1. Kondisi praktikan yang tidak aseptik, yang dapat menyebabkan terjadinya kontaminasi pada media tanam akibat dari mikroorganisme yang tersebar dan dibawa oleh praktikan. 
  2. Peralatan yang digunakan tidak steril.
  3. Terjadinya pengerasan pada media diakibatkan kelalaian dalam proses pemasakan media yang dilakukan secara berulang-ulang. 

VII.     KESIMPULAN                     :
            Dari praktikum yang telah dilakukan dapat disimpulkan bahwa :
  1. Keberhasilan dari pembuatan media tanam dipengaruhi oleh kondisi yang aseptik baik dari kondisi praktikan maupun dari peralatan yang digunakan.
  2. Dalam pembuatan media tanam kultur jaringan dapat terjadi karamelisasi yang diakibatkan pemanasan yang terlalu lama dan berulang-ulang.
  3. Dalam pembuatan media harus diperhatikan unsur-unsur apa saja yang diperlukan suatu tanaman tersebut, karena setiap tanaman memiliki kebutuhan unsur hara yang berbeda-beda.
VIII.    DAFTAR PUSTAKA          :
Edi, syahmi., 2007, Penuntun Praktikum Kultur Jaringan Tanaman, Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Negeri Medan, Medan.

Gunawan, L. W., 1995, Teknik Kultur In Vitro Dalam Hortikultura, PT. Penebar Swadaya, Jakarta.

Harahap, F., 2007, Kultur Jaringan Suatu Pengantar, Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Negeri Medan, Medan.

Nugroho, Arinto, Heru Sugito, 1996, Pedoman Pelakasanaan Teknik Kultur Jaringan.,Penebar Swadaya. Jakarta.


I           JUDUL PRAKTIKUM        : Perbanyakan Tanaman Kentang dan Anggrek
II.        TUJUAN PRAKTIKUM     :-. Untuk melatih praktikan agar mengetahui cara
                                                                 penanaman eksplan ke medium secara aseptik.
                                                             -. Agar praktikan dapat membedakan pengaruh          
                                                                media yang berbeda.
                                                             -. Agar praktikan membuktikan konsep            
                                                                totipotensial sel/jaringan/organ pada tumbuhan.
        
III.       TINJAUAN TEORITIS      :

PERBANYAKAN TANAMAN KENTANG DAN ANGGREK
            Kentang (Solanum tuberosum) dan Anggrek  telah dikenal baik oleh masyarakat Indonesia. Buah ini (kentang) sangat digemari oleh masrakat. Selain dimanfaatkan sebagai bahan makanan, kentang juga sebagai sumber karbohidrat yang banyak digunakan masyarakat sebagai pengganti beras/nasi. Kentang memiliki kadar gula lebih rendah dari beras/nasi sehingga banyak dimanfaatkan oleh para penderita diabetes sebagai bahan pengganti nasi.
            kentang merupakan tanaman herba yang dapat hidup dalam berbagai musim (perenial). Tanaman ini dapat digolongkan kedalam kelas dikotil. Salah satu keunikan dari tanaman kentang ini yaitu sebelum kentang memulai bertunas, kentang sebelumnya  mengalami masa dormansi atau masa istirahat. Pada fase ini kentang mengumpulkan enegi untuk memulai pertunasannya ketika sudah cukup energinya.
Kentang merupakan tumbuhan yang menjalar dengan membentuk umbi pada akar. Sebenarnya umbi tersebut merupakan cadangan makanan dari tumbuhan kentang sebagai mana halnya pada umbi jalar (Ipomoea batatas) dan umbi kayu (Manihot utilisima)
Berbeda dengan kentang, anggrek merupakan tumbuhan bunga-bungaan. Anggrek dimanfaatkan oleh manusia sebagai tanaman hias karena memiliki bentuk bunga yang indah dan beranakaragam warnanya. Anggrek memiliki banyak sekali jenis, bahkan ada asumsi bahwa persilangan anggrek ini tidak terbatas. Salah satu istri dari presiden kedua Indonesia berhasil menyilangkan
IV.       ALAT DAN BAHAN           :
                                                Alat dan Bahan
No
Alat dan bahan
Jumlah
1
Cawan Petri
2 buah
2
Pinset
2 buah
3
Gunting
2 buah
4
Pisau
2 buah
5
Api Bunsen
1 buah
6
Botol kultur
secukupnya
7
Botol alkohol
1 buah
8
Sprayer
1 buah
9
Tissue
Secukupnya
10
Eksplan
secukupnya

V.        PROSEDUR KERJA           :
  1. Sediakan alat dan bahan dalam laminar air flow cabinet yang siap digunakan, adapun alat dan bahan tersebut adalah: gunting, pinset, petridist, botol kosong, bunsen, beker glass, alkohol, eksplan nenas.
  2. Sebelum menanam harus dilakukan sterilisasi alat dan eksplan. Hal itu dapat dilakukan dengan cara sebagai berikut:
-          Rendam alat di dalam alkohol terlebih dahulu, setelah itu baru alat dipanaskan diatas bunsen setelah itu masukkan lagi dalam alkohol ataupun lansung digunakan dengan pertimbangan bahwa saat pemanasan jangan terlalu panas karena dapat merusak eksplan.
-          Setelah sterilisasi selesai dilakukan, barulah kita dapat mulai menanam. Mengambil eksplan yang akan ditanam dengan pinset letakan dipetridist lalu bersihkan dan memisah-misahkan eksplan yang akan ditanam. Hasil pemisahan eksplan ditanamkan dalam media yanga ada pada botol yang sudah disiapkan.
-          Setelah penanaman selesai, mulut botol tersebut dipanaskan terlebih dahulu sebelum ditutup.
-          Sebelumnya hitung terlebih dahulu jumlah daun pada eksplan tersebut sebagai awal tahap pertumbuhan eksplan untuk lebih lanjut sebagai pembanding tahap-tahap perkembangan tanaman tersebut.
-          Lakukan hal yang sama sampai selesai, jangan lupa bahwa setiap penggunaan alat pada saat penanaman harus disterilisasi terlebih dahulu.

VI.       PEMBAHASAN       :
            Pada perbanyakan tanaman nenas ini dilakukan sebanyak 18 botol. Jadi media yang digunakan adalah media MS, MS 11, MS Kinetin masing-masing sebanyak 6 botol. Adapun hal yang harus diperhatikan oleh praktikan pada saat melakukan penanaman yaitu:
Pada saat pensterilan alat dengan menggunakan bunsen jangan terlalu panas atau hindarkan alat tersentuh langsung dengan api. Karena apabila alat terlalu panas, saat tersentuh eksplan dapat mengakibatkan rusakknya jaringan yang tersentuh. Tentu saja apabila jaringan tersebut rusak maka akan terjadi kegagalan penanaman.
Pada saat peletakan eksplan kedalam media usahakan alat jangan terlalu dalam hingga menyentuh media karena dapat menyebabkan kontaminasi pada media tersebut.
Usahakan tangan praktikan ataupun yang lainnya tidak menyentuh tutup botol. Hal ini dilakukan untuk menghindari kontaminasi.
Pada saat penanaman alat yang digunakan haruslah disterilisasi terlebih dahulu dengan membakarnya dengan apai bunsen yang disediakan.
Praktikan juga pada saat proses penanaman jangan berbicara, karena nafas yang dihasilkan dikhawatirkan mengandung mikroorganisme yang dapat menyebabkan kontaminasi.




Tabel 1. Data Pengamatan Pertambahan Jumlah Daun Nenas
Media
Botol
Minggu I
Minggu II
Minggu III
Minngu IV
Minggu V
Minggu VI
Minggu VII
Minggu VIII
Minggu IX
Jumlah
Anakan
KI
1
2
3
4
5
6

9
9
11
9
7
9
10
10
11
8, layu 2
3, layu 4
9, layu 1


11
11
12, layu 1
10, layu 2
4, layu 5
5, layu 1

24
11, layu 2
14, layu 1
9, layu 2
17, layu 6
14, layu 2

29
12
15, layu 1
10, layu 3
18, layu 6
14, layu 3

30, layu 3
12, layu 1
16, layu 4
11, layu 3
25, layu 6
18, layu 4

43, layu 2
14, layu 2
18, layu 4
-
54, layu 6
28, layu 6

45, layu 4
15, layu 3
-
-
63, layu 6
36, layu 8

79, layu 12
16, layu 3
-
-
70, layu 7
48, layu 10


8 tunas



7 tunas
3 tunas
MS 11
1
2
3
4
5
6

9
9
7
6
5
8
10, layu 1
8, layu 1
8
7
6
8, layu 1

-
12
9
-
8
9, layu 1

-
15(kontam)
10
-
8
9, layu 1

-
-
10
-
8
10, layu 1

-
-
10
-
10
11, layu 3

-
-
11, layu 1
-
12, layu 1
13, layu 4

-
-
-
-
16, layu 1
15, layu 4

-
-
-
-
18, layu 2
16, layu 4





2 tunas
1 tunas
MS
1
2
3
4
5
6

9
6
5
7
7
9
9, layu 1
5, layu 1
7, layu 1
5, layu 3
9
11
11, layu 2
-
5, layu 3
7, layu 4
-
11
14, layu 3
-
8, layu 3
9, layu 2
-
13
15, layu 3
-
9, layu 3
6, layu 5
-
13

16, layu 3
-
12, layu 3
8, layu 5
-
13
23, layu 3
-
18, layu 3
14, layu 5
-
14, layu 1

26, layu 4
-
20, layu 5
-
-
13, layu 2

-
-
-
-
-
11, layu 5





1 tunas



Tabel 2. Data Pertambahan Jumlah Daun Nenas
Perlakuan
Pertambahan jumlah daun nenas (botol)
Total (∑)
X2
I
II
III
IV
V
VI
MS
*
*
*
*
*
7
7
7
49
MS 11
*
*
*
*
15
12
27
13,5
729
KI
82
10
*
*
70
49
211
52,75
4451
Jumlah
245
73,25
45299

Ho = tidak ada pengaruh perlakuan                          mo = m1 = 1
Ha = ada pengaruh perlakuan                         mom1 ≠ 1
Keterangan :
         *  = kontam
N = 18
t  = 3
v  FK                         = =
v  JK perlakuan        
                  =
                  =
                  = 11543,75-8575
                  = 2968,75
v  JK total                 =



v  JK galat/error        = JK total – JK perlakuan
      = 5968 - 2968,75
      = 2999,25
v  KT perlakuan       



v  KT galat/error



Tabel . ANAVA
Sumber Keragaman
db
JK
KT
FHA
F tabel
0,05
0,01
Perlakuan
2
2968,75
1484,37
7,42
3,68
6,36
Galat/eror
15
2999,25
199,95



Total
17
5968





F hitung > F tabel :
Ho ditolak Ha diterima
Artinya : Ada pengaruh perlakuan yang nyata pada taraf 5 % dan ada pengaruh perlakuan yang sangat nyata pada taraf 1 %

Uji BNT
Ø  BNT 




                                                                                            


Ø  Rataan :
MS         = Y1 =
MS 11    = Y2 =
Kinetin   = Y3 =
Ø  Lalu diurutkan dari yang kecil               yang besar.
MS         = Y1 =                                  (1)
MS 11    = Y2 =                              (2)
Kinetin   = Y3 =                           (3)
Ø  Tabel perbedaan antara rata-rata perlakuan (dikurangkan)
                     (3)                    (2)              (1)
(1)                 45,75*             6,5             -
(2)                 39,25*             -                 -
(3)                 -                       -                 -
Keterangan : yang > 24,69               * : artinya berbeda nyata ;
                     tanpa tanda * : artinya sama
                     segaris = sama
Kesimpulan :
1.      media MS 11 tidak nyata terhadap MS.
2.      media Kinetin berbeda nyata terhadap media MS dan MS 11.

Tabel 3. Data Pertambahan Jumlah Anakan Nenas
Perlakuan
Pertambahan jumlah daun nenas (botol)
Total (∑)
X2
I
II
III
IV
V
VI
MS
*
*
*
*
*
1
1
1
1
MS 11
*
*
*
*
2
1
3
1,5
9
KI
8
*
*
*
7
3
18
6
36
Jumlah
22
8,5
46
Ho = tidak ada pengaruh perlakuan                          mo = m1 = 1
Ha = ada pengaruh perlakuan                         mom1 ≠ 1
Keterangan :
         *  = kontam
N = 18
t  = 3
v  FK                          = =
v  JK perlakuan        
                  =
                  = 1+ 4,5 + 108 – 80,67
                  = 113,5 – 80,67
                                          = 32,83


v  JK total                





v  JK galat/error        = JK total – JK perlakuan
      = 47,33 -32,83
      = 14,5


v  KT perlakuan       





v  KT galat/error



Tabel . ANAVA
Sumber Keragaman
db
JK
KT
FHA
F tabel
0,05
0,01
Perlakuan
2
32,83
16,42
16,93
3,68
6,36
Galat/eror
15
14,5
0,97



Total
17






F hitung > F tabel :
Ho ditolak Ha diterima
Artinya : Ada pengaruh perlakuan yang nyata pada taraf 5 % dan ada pengaruh perlakuan yang sangat nyata pada taraf 1 %

Uji BNT


Ø  BNT 




                                                                                            
Ø  Rataan :
MS         = Y1 =
MS 11    = Y2 =
Kinetin   = Y3 =
Ø  Lalu diurutkan dari yang kecil               yang besar.
MS         = Y1 = 1                                  (1)
MS 11    = Y2 = 1,5                               (2)
Kinetin   = Y3 = 6                                  (3)


Ø  Tabel perbedaan antara rata-rata perlakuan (dikurangkan)
                     (3)                    (2)              (1)
(1)                 5*                    0,5             -
(2)                 4,5*                 -                 -
(3)                 -                       -                 -
Keterangan : yang > 1,39                 * : artinya berbeda nyata ;
                     tanpa tanda * : artinya sama
                     segaris = sama
Kesimpulan :
1.      media MS 11 berbeda tidak nyata terhadap MS.
2.      media Kinetin berbeda nyata terhadap media MS dan MS 11.

Tabel 4. Pertambahan Tinggi Tanaman Nenas Pada Media Yang Terkontam
Perlakuan
Pertambahan jumlah daun nenas (botol)
Total (∑)
X2
I
II
III
IV
V
VI
MS
*
*
*
*
*
3,2
3,2
3,2
10,24
MS 11
*
*
*
*
3,8
4,2
8
4
64
KI
8
*
*
*
5,2
4,1
18,9
4,73
357,21
Jumlah
30,1
11,93
431,45
Ho = tidak ada pengaruh perlakuan                          mo = m1 = 1
Ha = ada pengaruh perlakuan                         mom1 ≠ 1
Keterangan :
         *  = kontam
N = 18
t  = 3
v  FK                         = =
v  JK perlakuan        
                  =
                  = 10,24 + 32 + 89,30 – 129,43 = 2,11


v  JK total                





v  JK galat/error        = JK total – JK perlakuan
      = 3,5 -2,11
      = 1,39


v  KT perlakuan       





v  KT galat/error



Tabel . ANAVA
Sumber Keragaman
db
JK
KT
FHA
F tabel
0,05
0,01
Perlakuan
2
2,11
1,05
11,66
3,68
6,36
Galat/eror
15
1,39
0,09



Total
17
3,5





F hitung > F tabel :
Ho ditolak Ha diterima
Artinya : Ada pengaruh perlakuan yang nyata pada taraf 5 % dan ada pengaruh perlakuan yang sangat nyata pada taraf 1 %

Uji BNT


Ø  BNT 





                                                                                            
Ø  Rataan :
MS         = Y1 =
MS 11    = Y2 =
Kinetin   = Y3 =
Ø  Lalu diurutkan dari yang kecil               yang besar.
MS         = Y1 = 3,2                               (1)
MS 11    = Y2 = 4                                  (2)
Kinetin   = Y3 = 4,725                           (3)

Ø  Tabel perbedaan antara rata-rata perlakuan (dikurangkan)
                     (3)                    (2)              (1)
(1)                 1,525*             0,4             -
(2)                 0,725*             -                 -
(3)                 -                       -                 -
Keterangan : yang > 0,51                 * : artinya berbeda nyata ;
                     tanpa tanda * : artinya sama
                     segaris = sama
Kesimpulan :
1.      Media MS 11 berbeda tidak nyata terhadap media MS.
2.      Media Kinetin berbeda nyata terhadap media MS dan MS 11.

Tabel 5. Data Jumlah Akar Pada Pengamatan Terakhir (Minggu ke-9).
Perlakuan
Pertambahan jumlah daun nenas (botol)
Total (∑)
X2
I
II
III
IV
V
VI
MS
*
*
*
*
*
3
3
3
9
MS 11
*
*
*
*
3
2
5
2,5
25
KI
5
2
*
*
3
4
14
3,5
196
Jumlah
22
9
230
Ho = tidak ada pengaruh perlakuan                          mo = m1 = 1
Ha = ada pengaruh perlakuan                         mom1 ≠ 1
Keterangan :
         *  = kontam
N = 18
t  = 3
v  FK                         = =
v  JK perlakuan        
                  =
                  = 9 + 12,5 + 49 – 69,14 = 1,36


v  JK total                





v  JK galat/error        = JK total – JK perlakuan
      = 6,86 -1,36
      = 5,5


v  KT perlakuan       





v  KT galat/error



Tabel . ANAVA
Sumber Keragaman
db
JK
KT
FHA
F tabel
0,05
0,01
Perlakuan
2
1,36
0,68
1,88
3,68
6,36
Galat/eror
15
5,5
0,36



Total
17
6,86





F hitung > F tabel :
Ho ditolak Ha diterima
Artinya : Ada pengaruh perlakuan yang nyata pada taraf 5 % dan ada pengaruh perlakuan yang sangat nyata pada taraf 1 %

  1. % Kontaminasi
Ø  % Kontaminasi Pada Media MS
Ø  % Kontaminasi Pada Media MS 11

Ø  % Kontaminasi Pada Media Kinetin
  1. % Pertumbuhan Planlet
Ø  Media MS


=


x 100%
Jumlah planlet yang tumbuh
                              Jumlah planlet keseluruhan



Ø  Media MS 11
Ø  Media Kinetin
  1. % Yang Membentuk Akar
Ø  Media MS


x 100%


=
               Jumlah planlet yang membentuk akar
            Jumlah planlet yang ditanam keseluruhan
     
Ø  Media MS 11
Ø  Media Kinetin


VII.     KESIMPULAN         :
            Dari hasil penanaman yang dilakukan diatas maka dapat ditarik kesimpulan sebagai berikut:
  1. Dari ketiga media diatas, yang menunjukkan hasil terbaik untuk perbanyakan nenas adalah media Kinetin.
  2. Persentase kontaminan yang terbesar adalah pada media MS.
  3. Persentase pertumbuhan akar yang paling baik dari ketiga media diatas adalah media Kinetin.

VIII.    DAFTAR PUSTAKA          :

Gunawan, L. W., 1995, Teknik Kultur In Vitro Dalam Hortikultura, PT. Penebar Swadaya, Jakarta.

Nugroho, Arinto, Heru Sugito, 1996, Pedoman Pelakasanaan Teknik Kultur Jaringan.,Penebar Swadaya. Jakarta.


I.          JUDUL PRAKTIKUM        : Sterilisasi Eksplan Dari Lapang
II.        TUJUAN PRAKTIKUM     : Megetahui tahapan dalam mensterilisasi eksplan             
                                                              dari lapang
III.       TINJAUAN TEORITIS      :
EKSPLAN
            Faktor eksplan yang penting adalah bagian yang digunakan, genotip/varietas, umur eksplan , letak pada cabang dan seks (pohon jantan atau pohon betina ). Dalam usaha untuk mendapatkan kultur yang dapat tumbuh, memperbanyak diri, dan beregenerasi, perlu dicoba berbagai macam bagian tanaman seperti
- pucuk muda              - ovari muda
- batang muda             - kapitulum bunga
- daun muda                - embrio
- kotiledon                   - umbi
- hipokotiledon            - ujung akar
- endosperma               - dinding anter ( tangkai diploid )
            Dalam pemilihan bagian tanaman perlu juga dipertimbangkan tujuan dari kulturnya. Bagian – bagian tanaman yang masih muda, terutama kecambah memiliki mdaya regenerasi yang lebih tinggi daripada tanaman dewasa. Posisi eksplan yang diambil pada tanaman donor ( toposik ) dapat mempengaruhi kemampuan regenerasi . pada batang tembakau dan sisik umbi bunga lili. Daya regenerasi sisik umbi lili lapisan luar lebih tinggi dibandingkan sisik umbi lapisan dalam.
            Pada tanaman dioceous ( berumah dua ) di mana terdapat pohon jantan dan betina akan terdapat perbedaan kemampuan regenerasi. Dalam percobaan dengan Actinidia chinensis dan Populus ciliata , tanaman betina mepmpunyai kemampuan regenerasi akar yang lebih tinggi daripada tanaman jantan. Pada tanaman Melandrium, daun dari tanaman jantan hanya membentuk kalus yang mampu regenerasi.
Dalam kultur jaringan, inisisasi kultur yang bebas dari kontaminan merupakan langkah yang sangat penting. Bahan tanaman dari lapangan, mengandung debu, kotoran-kotoran, dan berbagai kontaminan hidup pada permukaannya. Kontaminan hidup dapat berupa cendawan, bakteri, serangga dan telurnya, tungau, serta spora-spora. Bila kontaminan ini tidak dihilangkan, maka pada media yang mengandung  gula, vitamin, dan mineral, kontaminan terutama cendawan dan bakteri akan tumbuh secara cepat. Dalam beberapa hari, kontaminan akan memenuhi seluruh botol kultur. Eksplan yang tertutup kontaminan akhirnya mati, dapat sebagai akibat langsung dari serangan cendawan/bakteri atau secara tidak langsung persenyawaan toksik yang diproduksi cendawan bakteri.
Pada setiap jenis tanaman, ditemukan juga kontaminan yang berasal dari jaringan tanaman, terutama bakteri. Bakteri-bakteri ini sampai sekarang belum diidentifikasi. Kontaminan internal ini sangat sulit diatasi, karena sterilisasi permukaan tidak menyelesaikan masalah. Pada bahan tanaman yang mengandung bahan kontaminan  internal, harus diberi perlakuan antibiotik atau fungisida yang sistemik.
Setiap bahan tanaman mempunyai tingkat kontaminasi yang berbeda, tergantung dari:
  1. Jenis tanamannya.
  2. Bagian tanaman yang dipergunakan.
  3. Morfologipermukaan (mis: berbulu atau tidak)
  4. Lingkungan tumbuhnya
  5. Musim waktu mengambil
  6. Umur tanaman
  7. Kondisi tanamannya
Keadaan ini menyukarkan suatu prosedur sterilisasi standar yang berlaku untuk semua tanaman. Juga sukar untuk menentukan prosedur  standar yang dapat dipergunakan untuk suatu jenis tanaman yang berasal dari tempat yang berbeda. Prosedur sterilisasi setiap bahan tanaman harus ditentukan melalui percobaan pendahuluan.
Sterilisasi Eksplan
Kultur jaringan / kultur in vitro meliputi penanaman se / agregat sel, jaringan dan organ tanaman di media dengan gula, vitamin, asam – asam amino , garam – garam anorganik, air, fitohormon, dan bahan pemadat media. Media tumbuh ini sangat menguntungkan bagi pertumbuhan cendawan dan bakteri. Beberapa jenis organisme mikro juga melepaskan persenyawaan toksik ke dalam media yang menyebabkan kematian jaringan tanaman. Oleh karena itu, dalam inisiasi sustu kultur harus diusahakan kultur yang aseptik.


Kontamonasi dapat berasal dari beberapa penyebab berikut:
  1. Sterilisasi media yag kurang sempurna
  2. Lingkungan kerja dan pelaksanaan
  3. Eksplan
  4. Serangga atau hewan kecil yang berhasil masuk ke dalam botol kultur setelah diletakkan di ruang kultur.
Sterilisasi ekspolan dapat dilaksanaan dengan 2 cara yaitu
1. Secara mekanik
            Cara ini digunakan untuk eksplan yang keras atau berdaging, yaitu dengan membakar eksplan tersebut di atas lampu spiritus sebanyak 3 kali. Eksplan keras yang disterilisasi dengan cara ini antara lain adalah  tebu, biji salak, bung, buah anggrek, kapulaga dan sebagainya. Sedangkan eksplan yang berdaging antara lain adalah wortel, umbi, bawang putih dan lain – lain.
2. Secara kimiawi
            Sterilisasi ini digunakan untuk eksplan yang lunak  (jaringan muda ) seperti daun, tangkai daun, anther dan sebagainya. Bahan kimia yang dapat digunakan adalah :
-          Sodium hipokhlorit ( clorox dan bayclin )
-          Mercuri klorit
-          Alkohol 70%


IV. ALAT DAN BAHAN    :
                                                Alat dan Bahan
No
Alat dan bahan
Jumlah
1
Cawan Petri
2 buah
2
Pinset
2 buah
3
Gunting
2 buah
4
Pisau
2 buah
5
Api Bunsen
1 buah
6
Botol kultur
secukupnya
7
Botol alkohol
1 buah
8
Sprayer
1 buah
9
Tissue
Secukupnya
10
Eksplan (Bawang Putih)
secukupnya

V.        PROSEDUR KERJA           :
  1. Menyediakan eksplan bawang putih dari lapang.
  2. Mencuci eksplan dengan deterjen dan disikat secar perlahan-lahan. Kemudian dibilas dengan air mengalir sampai bersih.
  3. Setelah bersih kembali dicuci dengan deterjen sambil dikocok-kocok.
  4. Dibilas dengan air dua kali sampi bersih.
  5. Dicuci dengan aquades steril.
  6. Derendam dengan dithane 0.5 gr + agrape 0.5 gr / 100 ml aquades steril selama 1-2 jam.
  7. Setelah 1- 2 jam dicuci dengan aquades steril sebanyak 2 kali.
  8. Direndam dalam klorox 20% selama 3 menit.
  9. Dicuci kembali dengan aquades steril.
  10. Direndam dalam klorox 100% selama 5 menit.
  11. Kemudian dicuci dengan aquades steril sebanyak 3 kali.
  12. Didalam laminar, bawang putih direndam dengan menggunkan anti septik seperti  amoxicilin 5  gr/ tablet/ 120 ml aquades.

VI.       PEMBAHASAN                   :
Bawang putih merupakan umbi yang termasuk lunak sehingga diperlukan sterilisasi eksplan dari lapang yang baik agar hasilnya lebih maksimal.  Sterilisasi yang cocok  digunakan untuk bawang putih sebenarnya adalah secara mekanis.( Sriyanti, D.P., DKK., 1994). Namun dalam percobaan ini digunakan beberapa jenis bahan kimia,salah satunya adalah klorok. Sementara bahan kimia tersebut digunakan untuk sterilisasi secara kimiawi yang digunakan untuk eksplan yang berbahan lunak (jaringan muda) seperti daun, tangkai daun, anther dan lain sebagainya sedangkan bawang putih termasuk kedalam eksplan yang berdaging.
Sterilisasi eksplan dari lapang ini dapat menentukan keberhasilan proses selanjutnya dalam kultur jaringan. Pada prinsipnya semua yang dilakukan dalam kultur jaringan harus dalam keadaan aseptik. Perendaman bawang putih dilakukan dalam laminar air flow sedangkan pencucian dengan deterjen masih dapat dilakukan diluar LAFC.
Konsentrasi untuk sterilnya suatu eksplan tergantung kepada kelunakan eksplan, dan waktu perendaman didalam larutan comtohnya larutan kolox.

VII.     KESIMPULAN                     :
  1. Bawang putih termasuk eksplan yang berdaging sehingga perlu dilakukan sterilisasi secara mekanik.
  2. Sterilisasi kimia pada bawang putih menggunakan bahan kimia klorox dan di dalam laminar air flow bawang putih diberi antibiotik amoxicilin.
  3. Konsentrasi larutan dan lamanya waktu perendaman sangat mempengaruhi sterilitas eksplan dari lapang.

VI.       DAFTAR PUSTAKA          :

Gunawan, L. W., 1995, Teknik Kultur In Vitro Dalam Hortikultura, PT. Penebar Swadaya, Jakarta.

Sriyanti, D.P., DKK., 1994, Tehnik Kultur Jaringan, Penerbit Kanisius, Yogyakarta.


I           JUDUL PRAKTIKUM        : Penanaman Eksplan Yang Berasal Dari Lapang.
II.        TUJUAN PRAKTIKUM     : Untuk melatih praktikan agar mengetahui cara
                                                               Penanaman eksplan dari lapang kedalam media.
III.       TINJAUAN TEORITIS      :
PENANAMAN EKSPLAN
Penanaman eksplan dilakukan didalan laminar air flow dengan kondisi aseptik. Sebelum kita bekerja didalam LAF, semua perhiasan tangan seperti cincin, jam dan sebagainya harus dilepas dan tangan dibasuh dulu dengan alkohol. Dalam menanam eksplan pekerja harus menggunkan masker penutup mulut terlebih dahulu. Alat ini dipergunakan dalam pekerjaan persiapan bahan tanaman dari satu botol ke botol yang lain dalam kultur invitro.
Laminar air flow cabinet terdapat dua macam filter :
-          pre filter yang merupakan saringan pertama terhadap debu-debu dan benda-benda yang kasar. pori-pori filter ini kira-kira 5 mikron sehingga efisiensinya mencapai 95 % untuk objek-objek yang lebih besar dari 5 mikron.
-          HEFA filter dengan por-pori 0.3 mikron dan terdapat pada bidang keluar udara kearah poermukaan tempat kerja.
LAF ada yang dilengkapi dengan UV ada juga tanpa UV. Apabila tidak dilengkapi dengan lampu UV blower harus dijalankan terus-menerus walaupun LAF sedang tidak digunakan hal ini dilakukan untuk menjaga kebersihan ruang kerja LAF tersebut.
Eksplan yang telah siap untuk ditanam dipotong-potong dengan skapel didalam cawan petri. Irisan eksplan dapat berbentuk segi empat, silender, segita, limas dan sebagainya, tergantung dari macam eksplannya. Irisan eksplan yang berbentuk silender seperti eksplan pucuk batang tebu merupakan irisan yang lebih baik karena mempunyai permukaan yang luas dan volumenya tinggi. Bentuk irisan yang demikian akan memudahkan pertukaran gas dan makanan sehingga eksplan tumbuh dengan baik. Potongan eksplan dimasukkan kedalam elenmeyer yang berisi media tumbuh, hingga permukaan yang teriris bersentuhan dengan medium. Selanjutnya elenmeyer ditutup kembali dengan aluminiumfoil dan diinkubasi didalam rak kultur.


IV.       ALAT DAN BAHAN           :
                                                Alat dan Bahan
No
Alat dan bahan
Jumlah
1
Cawan Petri
2 buah
2
Pinset
2 buah
3
Gunting
2 buah
4
Pisau
2 buah
5
Api Bunsen
1 buah
6
Botol kultur
secukupnya
7
Botol alkohol
1 buah
8
Sprayer
1 buah
9
Tissue
Secukupnya
10
Eksplan (bawang putih)
secukupnya

V.        PROSEDUR KERJA           :
  1. Sediakan alat dan bahan dalam laminar air flow cabinet yang siap digunakan, adapun alat dan bahan tersebut adalah: gunting, pinset, petridist, botol kosong, bunsen, beker glass, alkohol, eksplan bawang putih.
  2. Sebelum menanam harus dilakukan sterilisasi alat dan eksplan. Hal itu dapat dilakukan dengan cara sebagai berikut:
-          Rendam alat di dalam alkohol terlebih dahulu, setelah itu baru alat dipanaskan diatas bunsen setelah itu masukkan lagi dalam alkohol ataupun lansung digunakan dengan pertimbangan bahwa saat pemanasan jangan terlalu panas karena dapat merusak eksplan.
-          Setelah sterilisasi selesai dilakukan, barulah kita dapat mulai menanam.
-          Bawang putih di tanam pada media MS dalam keadaan utuh dengan posisi berdiri.
-          Umbi bawang putih utuh dibelah menjadi beberapa bagian yaitu: belah dua, belah tiga dan belah empat, kemudian ditanam pada media MS 11.
-          Eksplan bawang putih utuh lainnya dipotong menjadi beberapa bagian, yaitu potong 2, potong tiga dan potong empat. Kemudian ditanam pada media kinetin  
  1. Setelah penanaman selesai, mulut botol tersebut dipanaskan terlebih dahulu sebelum ditutup.
  2. Selanjutnya dilakukan pengamatan tiap minggunya sampai terbentuk tunas adventif pada endosperm bawang putih.




VI.       HASIL DAN PEMBAHASAN        :

 Tabel. Pengamatan Bawang Putih

MEDIA
18 mei 2007
25 mei 2007
1 juni 2007
8 juni 2007
15 juni 2007

K

I

N

E

T

I

N
Utuh
Belum tumbuh/ belum tunas
Belum tumbuh
Belum tumbuh
Belum tumbuh
Belum tumbuh
Potong 2
Belum tmbuh
Belum tumbuh
Belum tumbuh berwarna kehijauan
Belum tumbuh
Belum tumbuh warna hijau
Belah 2

1
Embrio ± 2 cm
Sudah tumbuh ± 4 cm
Sudah tumbuh
Sudah tumbuh kecil
Sudah tumbuh 1 ± 3 cm
2
Belum tumbuh
Kontam
Kontam
Kontam
Kontam
Potong 3
Belum tumbuh
Belum tumbuh
Belum tumbuh
Belum tumbuh
Belum tumbuh ( ada gelembung air dibawang)
Belah 3
Belum tumbuh
Belum tumbuh
Belum tumbuh
Belum tumbuh
Belum tunas
Potong 4
1
Embrio kecil keatas + jamur putih
Sudah tumbuh embrio keatas + jamur putih
Sudah tumbuh
Sudah tumbuh panjang (2)
Sudah tumbuh panjang
2
Belum tumbuh  + bercak merah
Kontam
Kontam
Kontam
Kontam
Belah 4
Belum tumbuh + bercak merah
Sudah tumbuh embrio
Sudah tumbuh (1) daun (3)
Sudah tumbuh (6)
Sudah tumbuh (6)


M
S




M

S
Utuh
Kontam, 4 koloni berwarna hijau + bercak merah
Kontam
Kontam
Kontam
Kontam
Potong 2
Belum tumbuh
Belum tumbuh
Belum tumbuh
Belum tumbuh
Belum tumbuh
Belah 2
1
Embrio terpisah dari bawang
Belum tumbuh ujung hijau
Belum tumbuh
Belum tumbuh ujung hijau
Belum tumbuh ujung hijau
2
Kontam
Kontam
Belum tumbuh
Kontam
Kontam
Potong 3
Belum tumbuh
Belum tumbuh
Belum tumbuh
Belum tumbuh
Belum tumbuh
Belah 3
Belum tumbuh
Belum tumbuh
Belum tumbuh
Belum tumbuh
Belum tumbuh + warna hijau diujung bawang
Potong 4
1
Belum tumbuh
Belum tumbuh
Belum tumbuh
Belum tumbuh
Belum tumbuh
2
Belum tumbuh
Kontam
Kontam
Kontam
Kontam
Belah 4
Kontam + jamur hijau + bercak merah
Belum tumbuh
Sudah tumbuh mata tunas, ujung hijau
Belum tumbuh
Kontam ada jamur berwarna merah


M
S
11
Utuh
Kontam + koloni hitam
Belum tumbuh
Belum tumbuh
Belum tumbuh
Belum tumbuh
Potong 2
Kontam + jamur warna hitam + bercak merah
Kontam
Kontam
Kontam
Kontam
Belah 2
1
Muncul tunas baru
Kontam
Kontam
Kontam
Kontam
2
Kontam + bercak merah
Kontam
Kontam
Kontam
Kontam
Potong 3
Embrio tumbuh keatas + jamur hijau
Kontam
Kontam
Kontam
Kontam
Belah 3
Kontam + bercak merah
Kontam
Kontam
Kontam
Kontam
Potong 4
1
Ada tumbuh embrio
Belum tumbuh
Belum tumbuh
Belum tumbuh
Belum  tumbuh warna kehijauan
2
Kontam
Belum tumbuh
Belum tumbuh
Belum tumbuh
Belum tumbuh ada gelembung air dibawah
Belah 4
Ada tumbuh embrio
Sudah embrio
Tunas (1), akar (2), daun (1).
Sudah tumbuh (2)
Sudah tumbuh


Dari hasil pengamatan selama beberapa minggu pada media yang digunakan seperti kinetin, MS, MS 11, maka diketahui bahwa pada media kinetinlah diperoleh perbedaan hasil dari media yang lain. Walaupun tidak diperoleh hasil yang cukup baik. Dari data yang diperoleh diketahui bahwa yang menggunakan perlakuan belah 2 dan potong 4 memperlihatkan adanya pertumbuhan embrio. Pertumbuhan ini dapat dipengaruhi oleh  beberapa faktor yang dapat mendukungnya, diantaranya :
  • ZPT ( zat pengatur tumbuh )
Karena pada media yang memiliki ZPT saja yang memperlihatkan adanya pertumbuhan embrio yang cukup baik, meskipun pada media yang tidak memiliki ZPT ada pertumbuhan tunas. Media yang mengandung ZPT seperti kinetin dan MS 11, pertumbuhan embrio yang terbanyak terlihat pada media MS 11 sedangkan pada media kinetin kurang menampakkan hasilnya. Dari pengamatan tersebut terlihat bahwa dalam pembentukan embrio, ZPT yang terkandung pada media MS 11 yang sesuai dengan pertumbuhan embrio pada bawang putih.
  • Perlakuan yang digunakan.
Perlakuan yang digunakan pada bawang putih juga dapat mempengaruhi pertumbuhan embrio. Perlakuan tersebut yang berupa pemotongan, pembelahan bahkan perlakuan secara utuh pada umbi bawang putih. Dari pengamatan yang telah dilakukan didapat hasil bahwa perlakuan “belah” yang paling mempengaruhi pertumbuhan embrionya, dan hasil tersebut terdapat pada media MS 11.
  • Pemotongan yang tidak merata.
Perlakuan membelah  dan memotong bawang putih dapat juga mempengaruhi proses pertumbuhan embrio. Karna pemotongan yang tidak merata sehingga pada potongan tertentu bawang putih tersebut ada yang tidak memiliki embrio. Kemudian posisi peletakkan bawang putih pada media juga mempengaruhi, sebaiknya bagian pangkal bawang putih diletakkan menyentuh media.


VII.     KESIMPULAN         :
            Dari hasil penanaman yang dilakukan diatas maka dapat ditarik kesimpulan sebagai berikut:
  1. Media yang menunjukkan pertumbuhan embrio yang paling  banyak ialah media adalah media kinetin.
  2. Perlakuan pemotongan yang menunjukkan pertumbuhan embrio yang banyak ialah pada perlakuaan belah baik belah 2, 3 maupun 4.
  3. Banyak faktor yang mempengaruhi pertumbuhan embrio dari endosperm bawang putih. Adapun faktor-faktor tersebut ialah :
-          Pemotongan yang tidak merata.
-          Perlakuan yang diberikan.
-          Pemberian zpt yang sesuai.

VIII.    DAFTAR PUSTAKA          :

Sriyanti, D.P., DKK., 1994, Tehnik Kultur Jaringan, Penerbit Kanisius, Yogyakarta.
Nugroho, Arinto, Heru Sugito, 1996, Pedoman Pelakasanaan Teknik Kultur Jaringan.,Penebar Swadaya. Jakarta.


I.          JUDUL PRAKTIKUM        : Induksi Kalus.
II.        TUJUAN PRAKTIKUM     : Megetahui tahapan dalam menginduksi kalus                                      pada tanaman krisan.
III.       TINJAUAN TEORITIS      :
INDUKSI KALUS KRISAN
Krisan merupakan tanaman bunga hias berupa perdu dengan sebutan lain Seruni atau Bunga emas (Golden Flower) berasal dari dataran Cina. Krisan kuning berasal dari dataran Cina, dikenal dengan Chrysanthenum indicum (kuning), C. morifolium (ungu dan pink) dan C. daisy (bulat, ponpon). Di Jepang abad ke-4 mulai membudidayakan krisan, dan tahun 797 bunga krisan dijadikan sebagai simbol kekaisaran Jepang dengan sebutan Queen of The East. Tanaman krisan dari Cina dan Jepang menyebar ke kawasan Eropa dan Perancis tahun 1795. Tahun 1808 Mr. Colvil dari Chelsa mengembangkan 8 varietas krisan di Inggris. Jenis atau varietas krisan modern diduga mulai ditemukan pada abad ke-17. Krisan masuk ke Indonesia pada tahun 1800. Sejak tahun 1940, krisan dikembangkan secara komersial.
Krisan  merupakan bunga potong yang mempunyai nilai ekonomi tinggi,sehingga prospeknya sangat baik. Pasar potensial bunga krisan  antara lain Jerman, Inggris, Italia, Swiss, Australia, Amerik Selatan, Swedia, Denmark, Jepang dan lainnya. Dalam rangka memenuhi kebutuhan bunga krisan  dalam negeri dan luar negeri (ekspor), Indonesia berpeluang untuk mengembangkan usaha bunga krisan.Krisan  dapat diperbanyak secara generatif dan vegetatif. Perbanyakan bunga krisan secara generatif jarang dilakukan karena sulit dan bersifat neterozigot (keturunan dari biji
tidak sama dengan induknya). Selain itu,perbanyakan secara generatif membutuhkan waktu lama dan penanganan khusus.  Perbanyakan krisan  secara vegetatif biasanya melalui setek pucuk, anakan dan kultur jaringan. Perbanyakan krisan  secara kultur jaringan dapat menghemat waktu dan  dapat diperoleh jumlah bibit krisan banyak. Menurut Nugroho dan Sugito (2000) tanaman krisan  dapat dikembangkan dengan kultur jaringan melalui teknik meristem culture yaitu teknik kultur jaringan dengan menggunakan bagian tanaman jaringan muda atau meristem. Selain itu, kelebihan kultur meristem yang mampu menghasilkan bibit tanaman identik dengan induknya. Rice et al. (1992) mengatakan bahwa kultur meristem mampu  meningkatkan laju induksi dan penggandaan tunas, mampu memperbaiki mutu bibit yang dihasilkan, serta mampu mempertahankan sifat-sifat morfologi yang positif. Dalam kultur jaringan sangat diperlukan zat pengatur tumbuh untuk merangsang pertumbuhan dan morfogenesis dalam kultur sel, jaringan dan organ (Gunawan, 1987). Zat pengatur tumbuh yang digunakan adalah sitokinin dan auksin. Sitokinin yang biasa  digunakan 6-Benzil Amino Purin (BAP) dan kinetin, sedang auksin yang digunakanadalah IAA, NAA dan IBA. Zat pengatur tumbuh ini diperlukan untuk pertumbuhan eksplan. Menurut Hendaryono dan Wijayanti (1994) pembentukan kalus, jaringan kuncup dan jaringan akar ditentukan oleh penggunaan zat pengatur tumbuh yang tepat baik macam maupun konsentrasinya.

IV. ALAT & BAHAN                      :

Alat dan bahan yang digukan adalah sebagai berikut :
No
Alat dan bahan
Jumlah
1.
Botol kultur
7 buah
2.
gunting
1 buah
3.
pinset
1 buah
4.
Cawan petridish
1 buah
5.
alkohol
secukupnya
6.
Media MS
secukupnya
7.
2,4 D
secukupnya
8.
kinetin
secukupnya

V.        PROSEDUR KERJA           :
  1. Sediakan alat dan bahan dalam laminar air flow cabinet yang siap digunakan, adapun alat dan bahan tersebut adalah: gunting, pinset, petridist, botol kosong, bunsen, beker glass, alkohol, eksplan krisan.
  2. Sebelum menanam harus dilakukan sterilisasi alat dan eksplan. Hal itu dapat dilakukan dengan cara sebagai berikut:
-          Rendam alat di dalam alkohol terlebih dahulu, setelah itu baru alat dipanaskan diatas bunsen setelah itu masukkan lagi dalam alkohol ataupun lansung digunakan dengan pertimbangan bahwa saat pemanasan jangan terlalu panas karena dapat merusak eksplan.
-          Setelah sterilisasi selesai dilakukan, barulah kita dapat mulai menanam. Mengambil eksplan yang akan ditanam dengan pinset letakan dipetridist lalu bersihkan dan memisah-misahkan eksplan yang akan ditanam. Bagian tanaman yang dipisahkan terdiri dari bagian batang, tangkai daun dan daun. Untuk daun dibuat menjadi 2 bagian.
-          Hasil pemisahan eksplan ditanamkan dalam media yang ada pada botol yang sudah disiapkan. Untuk bagian daun, satu bagian diletakkan secara adaksial dan satu bagian lagi secara abaksial.
-          Setelah penanaman selesai, mulut botol tersebut dipanaskan terlebih dahulu sebelum ditutup.
-          Melakukan pengamatan setiap minggunya sampai dihasilkan perubahan yang membentuk kalus.

VI.       PEMBAHASAN                   :
            Berdasarkan pengamatan sampai minggu ke-4 (1 juni 2007) terlihat tidak ada perubahan yang nyata dari kedua media yang digunakan. Daun terlihat agak lebar dibandingkan pada saat awal penanaman. Sedangkan pada tangkai dan batang tidak terlihat adanya perubahan pada kedua media.
            Pada pengamatan minggu ke-5 (8 juni 2007) telihat adanya pembengkakan yang terdapat pada potongan daun adaksial dan potongan daun abaksial, sedangkan pada tangkai ataupun batang tidak telihat adanya pembengkakan atau perubahan.
Pada pengamatan minggu ke-7 (22 juni 2007) pada media A yaitu pada botol A1 terlihat kalus sudah terbentuk tetapi ukuran kalus tersebut sangat kecil, sedangkan pada botol A2 kalus juga sudah terbentuk. Pada media B yaitu pada B1 dan B2 terlihat kalus sudah terbentuk dan ukurannya besar.
Dari ketujuh media yang telah digunakan tidak semua kalus terbentuk. Karena ada sebagian dari media yang terkontaminasi. Dari data yang terlihat hanya 4 botol yang tersisa dan hasilnya pun tidak begitu baik. Kalus yang baik diciri-cirikan dengan bergerombol, warna agak kehijauan dan pinggiran yang pecah atau merekah. Kalus seperti ini dapat dihasilkan dengan menginduksi kalus pada ruangan yang gelap ataupun botol media dapat dibungkus dengan menggunakan kain berwarna gelap.
Kalus yang baik kemudian dapat di sub kulturkan sesuai dengan keinginan kita. Misalnya untuk menumbuhkan akar maka kita harus menggunakan zpt yang dapat mernagsang pertumbuhan akar dan media yang sesuai.

VII.     KESIMPULAN                     :
  1. Pertumbuhan kalus dapat terlihat dengan adanya pembengkakan pada potongan organ tanaman.
  2. Pertumbuhan kalus yang baik dapat terlihat pada media B.
  3. Kalus dapat tumbuh baik pada ruangan yang gelap atau tidak bercahaya. Bisa juga dengan menutup botol media dengan kain yang berwarna gelap.
  4. Kalus yang baik diciri-cirikan dengan bergerombol, warna agak kehijauan dan pinggiran yang pecah atau merekah.

VIII.    DAFTAR PUSTAKA          :

Gunawan, L. W., 1995, Teknik Kultur In Vitro Dalam Hortikultura, PT. Penebar Swadaya, Jakarta.

Sriyanti, D.P., DKK., 1994, Tehnik Kultur Jaringan, Penerbit Kanisius, Yogyakarta.